材料及び方法
(1) コゴメグサの採取について
日本のコゴメグサについては、以下の３種を採集した。
ミヤマコゴメグサ Euphrasia insignis susp. insignis var. insignis
採集日時及び場所 ： 2015年7月28日 15:30 八方尾根
（東経138度47分 北緯36度41分 標高1900～2000ｍ）
タチコゴメグサ Euphrasia maximowiczii
採集日時及び場所 ： 2015年7月28日 10:00 白樺高原 八ケ峰公園
（東経138度14分 北緯36度5分 標高1600ｍ）
ヒメコゴメグサ Euphrasia matsumurae
採集日時及び場所 ： 2015年7月27日 10:00 金峰山山頂
（東経138度37分 北緯35度52分 標高2599ｍ）
ニュージーランドのコゴメグサについては、2種を採集したが、種名については確定できていない（写真２参照 写真下の学名はとりあえず候補として考えているもの）。
採集日時及び場所 ： 2016年1月29日 11:30 マッキノン峠の手前の森林限界を超えた草地
（東経167度8分 南緯44度8分）
(2) ＤＮＡ抽出、ＰＣＲによる遺伝子増幅、及びシークエンサーによる塩基配列の決定
（実験について詳細を知りたい方は、PDFを参照して下さい。）
ＤＮＡの抽出はＣＴＡＢ法による。ＣＴＡＢ法については参考文献３を参照。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りです。すべて、いわゆるユニバーサルプライマーで特別なものは必要ありませんでした。
＜遺伝子＞ ＜プライマーの名称＞ ＜ 塩 基 配 列 ＞
ITS ITS4 5'-ATTGATATGCTTAAACTCAGCG-3'
ITS5 5'-AACCTGCGGAAGGATCATTGTC-3'
TrnL-TrnF TrnL-cF 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
TrnF-fR 5'-GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3'
atpB-rbcL atpb-F 5'-AAAGGCTACATCTAGTACCGGACC-3'
rbcL-R 5'-GCTTTAGTCTCTGTTTGTGGTGACAT-3'
rps2 rps2-47F 5'-CTCGTTTTTTATCTGAAGCCTG-3'
rps2-66R 5'-ACCCTCACAAATAGCGAATACCAA-3'
matK matK-472F 5'-CCCRTYCATCTGGAAATGAGAAAGATTTCTGC-3'
matK-1248R 5'-GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC-3'
PCRは94℃1分、55℃1分、72℃１分のサイクルを35回繰り返しました。
PCR後はCIAP処理を行い、シーケンス処理までの間は4℃または凍結保存しておきました。
オートサイクルシーケンスによる塩基配列の決定は、フォルムアミドによるヒートショックの後、Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzerによって実行しました。
(3) 系統解析
得られた遺伝子の塩基配列データををもとに、先の参考文献１や２に掲載されているEuphrasia各種についてはNCBIの遺伝子データバンクからダウンロードして系統樹を作成しました。matKの塩基配列情報については、直接NCBIのデータバンクで検索を行い、主としてEuphrasia節に属するもののデータしかありませんでしたが、ダウンロードして新たに得られた日本及びニュージーランドの種のデータと合わせて、系統樹を作成しました。
系統樹は主としてMrbayesというBayes統計学に基づいて系統樹を作成するソフトを用いました。MrBayesを用いたのは、参考文献１でもつかわれていたので、結果を比較するのには、同じソフトを用いた方が良いであろうと思われたこと、また、UbuntuというLinuxをＯＳとしているＰＣであれば、BEAGLEライブラリや複数コアを持つCPUを効率的につかえるmpiパッケージを導入しながらソースコードからコンパイルして用いることで処理速度を相当に上げられたこと、などです。
MrBayes及びMrBayesによる解析を行う上で必要な他のソフトを含めた使用法については、別に
MrBayesの使用法（PDF）を作成してありますので、ご参照下さい。
なお、本サイトで提示されるBayes法による系統樹は、すべて50％多数決合意樹（50％-majority rule consensus tree）
です。
日本のコゴメグサについては、以下の３種を採集した。
ミヤマコゴメグサ Euphrasia insignis susp. insignis var. insignis
採集日時及び場所 ： 2015年7月28日 15:30 八方尾根
（東経138度47分 北緯36度41分 標高1900～2000ｍ）
タチコゴメグサ Euphrasia maximowiczii
採集日時及び場所 ： 2015年7月28日 10:00 白樺高原 八ケ峰公園
（東経138度14分 北緯36度5分 標高1600ｍ）
ヒメコゴメグサ Euphrasia matsumurae
採集日時及び場所 ： 2015年7月27日 10:00 金峰山山頂
（東経138度37分 北緯35度52分 標高2599ｍ）
ニュージーランドのコゴメグサについては、2種を採集したが、種名については確定できていない（写真２参照 写真下の学名はとりあえず候補として考えているもの）。
採集日時及び場所 ： 2016年1月29日 11:30 マッキノン峠の手前の森林限界を超えた草地
（東経167度8分 南緯44度8分）
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| Euphrasia revoluta(!?) | Euphrasia zelandica(!?) |
(2) ＤＮＡ抽出、ＰＣＲによる遺伝子増幅、及びシークエンサーによる塩基配列の決定
（実験について詳細を知りたい方は、PDFを参照して下さい。）
ＤＮＡの抽出はＣＴＡＢ法による。ＣＴＡＢ法については参考文献３を参照。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りです。すべて、いわゆるユニバーサルプライマーで特別なものは必要ありませんでした。
＜遺伝子＞ ＜プライマーの名称＞ ＜ 塩 基 配 列 ＞
ITS ITS4 5'-ATTGATATGCTTAAACTCAGCG-3'
ITS5 5'-AACCTGCGGAAGGATCATTGTC-3'
TrnL-TrnF TrnL-cF 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
TrnF-fR 5'-GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3'
atpB-rbcL atpb-F 5'-AAAGGCTACATCTAGTACCGGACC-3'
rbcL-R 5'-GCTTTAGTCTCTGTTTGTGGTGACAT-3'
rps2 rps2-47F 5'-CTCGTTTTTTATCTGAAGCCTG-3'
rps2-66R 5'-ACCCTCACAAATAGCGAATACCAA-3'
matK matK-472F 5'-CCCRTYCATCTGGAAATGAGAAAGATTTCTGC-3'
matK-1248R 5'-GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC-3'
PCRは94℃1分、55℃1分、72℃１分のサイクルを35回繰り返しました。
PCR後はCIAP処理を行い、シーケンス処理までの間は4℃または凍結保存しておきました。
オートサイクルシーケンスによる塩基配列の決定は、フォルムアミドによるヒートショックの後、Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzerによって実行しました。
(3) 系統解析
得られた遺伝子の塩基配列データををもとに、先の参考文献１や２に掲載されているEuphrasia各種についてはNCBIの遺伝子データバンクからダウンロードして系統樹を作成しました。matKの塩基配列情報については、直接NCBIのデータバンクで検索を行い、主としてEuphrasia節に属するもののデータしかありませんでしたが、ダウンロードして新たに得られた日本及びニュージーランドの種のデータと合わせて、系統樹を作成しました。
系統樹は主としてMrbayesというBayes統計学に基づいて系統樹を作成するソフトを用いました。MrBayesを用いたのは、参考文献１でもつかわれていたので、結果を比較するのには、同じソフトを用いた方が良いであろうと思われたこと、また、UbuntuというLinuxをＯＳとしているＰＣであれば、BEAGLEライブラリや複数コアを持つCPUを効率的につかえるmpiパッケージを導入しながらソースコードからコンパイルして用いることで処理速度を相当に上げられたこと、などです。
MrBayes及びMrBayesによる解析を行う上で必要な他のソフトを含めた使用法については、別に
MrBayesの使用法（PDF）を作成してありますので、ご参照下さい。
なお、本サイトで提示されるBayes法による系統樹は、すべて50％多数決合意樹（50％-majority rule consensus tree）
です。